CellPulse

IGF-Projekt: 20134 N  (2018 - 2020)

DIE HERAUSFORDERUNG

Eine präzise Zellmanipulation bietet für biomedizinische Applikationen vielfältiges Einsatzpotenzial. Neben der Zellaufreinigung ist vor allem eine Einbringung von Fremdsubstanzen (z. B. Xenobiotika, Nukleinsäuren, Peptide) in das Zytoplasma von Zielzellen von Interesse. Zudem könnte eine zellschonende, hochpräzise und insbesondere standardisierbare Methode der Zellmanipulation grundlegend zu zahlreichen neuartigen Anwendungen in der Biotechnologie und in der klinischen Praxis (hier vor allem in immunologischen Verfahren, Krebs-Immuntherapie und Stammzelltherapien) beitragen. Die gegenwärtig genutzten Techniken der Zellmanipulation beruhen allerdings meist auf mechanischen oder chemischen Prinzipien und sind oft durch einen hohen apparativen Aufwand, keine konstant hohe Effizienz, eine hohe Belastung der Zellen und/oder mangelnde Zellselektivität gekennzeichnet. Ein Verfahren, das bei hohem Durchsatz gleichzeitig hochspezifisch, standardisierbar und Substanzunabhängig für die Zellmanipulation verwendet werden kann, war bislang nicht in greifbarer Nähe.

DIE INNOVATIONSIDEE

Ziel des IGF-Vorhabens CellPulse war die transiente Permeabilisierung von Säugerzellen im Hochdurchsatz mithilfe von einzelnen Sub-Nanosekunden-Laserpulsen ohne Applikation exogener Absorber.

In einem experimentellen Aufbau am Lichtmikroskop sollten unter Verwendung eines Nd:YVO₄-Lasers die Parameter Pulsenergie, Energiedichte, Rayleighlänge (Abstand zum Fokus, in dem sich die Strahlquerschnittsfläche verdoppelt) und Fokuslage (in Relation zur Zelle) variiert und hinsichtlich ihrer Effekte auf adhärent (auf Oberflächen) wachsenden Zielzellen bewertet werden. Das Ausmaß der transienten Zellpermeabilisierung unter Erhalt der Zellvitalität als Reaktion auf die Auslösung photophysikalischer Prozesse sollte durch den Substanztransfer in die Zellen bewertet werden.

Basierend auf den optimierten Parametern für die transiente Manipulation immobilisierter Zellen sollte anschließend die flächige Zellpermeabilisierung erforscht werden.

DIE ERGEBNISSE

Die verwendete Laserstrahlquelle, ein gütegeschalteter Nd:YVO₄-Laser (die Pulse werden verkürzt und die Laserleistung während des Pulses erhöht), wurde in ein inverses Fluoreszenzmikroskop eingekoppelt. Die Fokussierung auf die Proben erfolgte mit dem Mikroskopobjektiv, das gleichzeitig zur visuellen Probenbetrachtung verwendet wurde. Entsprechend möglicher Zielanwendungen (Biotechnologie und Medizin) wurden die Säugerzelllinien CHO und THP-1 beschossen und die Parameter Pulsenergie, Energiedichte, Rayleighlänge und Fokuslage variiert. Als Nachweis der transienten Permeabiliserung vitaler Zellen wurde fluoreszenzmarkiertes Phalloidin und als Totfarbstoff Propidiumiodid verwendet.

Während stark fokussierte Pulse mit hoher Energiedichte neben der Permeabilisierung einen starken Abtrag und die Elimination von Zellen bewirkten, konnten durch einen weniger stark fokussierten und gegenüber dem Zellrasen axial verschobenen Puls Abtrag und Elimination stark reduziert werden. Die Prozessierungsgeschwindigkeit zeigte sich als kritisch für den Permeabilisierungserfolg. Die Effizienz des Substanztransfers war dagegen weitgehend unempfindlich gegenüber geringfügigen axialen Fokusvariationen.

Eine flächige Zellpermeabilisierung war also reproduzierbar unter weitgehender Vermeidung laserpulsinduziertem Zellabsterbens bei Fokussierung in den Zellkulturüberstand möglich. Dies ermöglicht einen zeitlich und räumlich kontrollierten Transport von Substanzen aus dem umgebenden Medium in die Zellen. Dabei ist eine zelllinienspezifische Optimierung der Bestrahlungsparameter empfehlenswert.

KMU-NUTZEN

Die entwickelte Technologie kann in den Life Sciences, der in vitro Diagnostik, Wirkstoffforschung und in therapeutischen Verfahren in der Human- und Veterinärmedizin eingesetzt werden. KMU, mit meist geringen Forschungsetats, können das Verfahren in bestehende Geräte zur Hochdurchsatz-Zellbeobachtung und vergleichbare automatisierte Mikroskope oder High Content Screening Systeme implementieren. Dadurch erfahren die Systeme eine substanzielle Applikationserweiterung und stärken die Wettbewerbsfähigkeit der Unternehmen.

In zukunftsweisenden Technologien wie Organ-on-Chip eröffnet die Technologie die Möglichkeit, Zellen in ihrem Gewebeverband zielgerichtet zu manipulieren. Dadurch werden sowohl in der in vitro Diagnostik als auch in der Wirkstoffforschung neue Verfahren möglich, von denen KMU profitieren können. Applikationsbegleitend ist zu erwarten, dass neue diagnostische Tests für den Erfolg der Zellmanipulationen entwickelt und vertrieben werden können.

Bei der Manipulation von Immunzellen im Rahmen von therapeutischen Verfahren, wie der (Tumor)vakzinierung, könnte das Verfahren für den reproduzierbaren Transfer von Molekülen in das Zytoplasma antigenpräsentierender Zellen ex vivo verwendet werden, was die Standardisierung und damit die Zulassungschancen erheblich verbessern kann.

Laufzeit: 01.04.2018 - 30.11.2020